توالی یابی دی ان ای (Sequencing DNA)

توالی­یابی DNA فرایندی برای تعیین دقیق ترتیب نوکلئوتیدهای درون مولکول DNA می­باشد. توالی­یابی شامل هر روش یا فن­آوری ای است که ترتیب چهار باز آدنین، گوانین، سیتوزین و تیمین را در یک رشته از DNA تعیین می­کند. ظهور روش­های توالی­یابی سریع DNA تا حد زیادی به تحقیقات و اکتشافات در زیست­شناسی و پزشکی کمک کرده است.

دانش توالی­یابی DNA برای تحقیقات زیست­شناسی پایه، به یک ضرورت تبدیل شده است و در زمینه­های کاربردی متعددی مانند تشخیص پزشکی، بیوتکنولوژی، پزشکی قانونی، ویروس­شناسی و زیست­شناسی سیستماتیک استفاده می­شود. سرعت بالای توالی­یابی که از طریق تکنولوژی­های مدرن بدست آمده است برای توالی­یابی کامل DNA و یا ژنوم گونه­های مختلف جانوران همچون ژنوم انسان، بسیاری از حیوانات، گیاهان، و گونه های میکروبی مورد استفاده قرار گرفته است.

در اوایل دهه­ی ۱۹۷۰توالی­یابی DNA برای اولین بار توسط محققان دانشگاهی با استفاده از روش دشوار کروماتوگرافی دو بعدی به دست آمد. به دنبال توسعه­ی روش های مبتنی بر فلوئورسانس روش هایی ابداع گردیده که در آنها از یک توالی یاب دی ان ای استفاده می شود^(۱)، به کمک این توالی یاب ها، توالی­یابی DNA آسان­تر و سریع­تر شده است^(۲).

کاربردها

توالی­یابی DNA می­تواند برای تعیین توالی ژن­های خاص، نواحی ژنتیکی بزرگ (به عنوان مثال خوشه­های ژنی یا اپرون ها)، کروموزوم­ها و یا کل ژنوم هر موجودی استفاده شود. تعیین توالی­ DNA کارآمدترین راه برای توالی­یابی RNA یا پروتئین (از طریق قالب­های خوانش باز) می­باشد. در واقع، توالی­یابی DNA یک تکنولوژی کلیدی در بسیاری از گرایش­های زیست­شناسی از جمله زیست­شناسی مولکولی و زیست­شناسی تکاملی و علوم دیگر مانند متاژنومیکس پزشکی، پزشکی قانونی و یا انسان­شناسی است.

چهار باز متعارف

ساختار متعارف DNA شامل چهار باز تیمین (T)، آدنین (A)، سیتوزین (C) و گوانین (G) می­باشد. توالی­یابی DNA تعیین ترتیب فیزیکی این بازها در یک مولکول DNA است. با این حال، بازهای دیگری نیز می­توانند در این مولکول وجود داشته باشند. در برخی از ویروس­ها (به طور خاص باکتریوفاژ)، سیتوزین می­تواند با متیل هیدروکسی و یا سیتوزین گلوکز متیل هیدروکسی جایگزین شود^(۳). در DNA پستانداران، بازهای مختلف با گروه­های متیل یا فسفوسولفات نیز می­توانند یافت شوند^{(۴ و ۵)}. بسته به روش توالی­یابی، تغییرات خاص مانند باز 5 متیل سیتوزین که در انسان متداول است می­تواند شناسایی شود^(۶).

روش­های توالی­یابی DNA

روش­های مختلفی برای توالی­یابی DNA وجود دارد که اسامی آن­ها در ذیل آورده شده است:

1- روش­های اولیه توالی­یابی DNA

• • توالی یابی کل ژنوم (Sequencing of full genomes)
  • روش های توالی یابی با بازدهی بالا (High-throughput sequencing (HTP) methods)

2- روش­های پایه

• توالی یابی به روش ماکسام گیلبرت
• روش اختتام زنجیره (Chain-termination methods)

3- روش­های پیشرفته و توالی­یابی از نو

• توالی یابی تفنگ ژنی
• Bridge PCR

4- روش­های با برون­ده بالا

• Massively parallel signature sequencing (MPSS)
• Polony sequencing
•  pyrosequencing
• Illumina (Solexa) sequencing
• SOLID sequencing
• Ion Torrent semiconductor sequencing
• DNA nanoball sequencing
• Heliscope single molecule sequencing
• Single molecule real time (SMRT) sequencing
• Nanopore DNA sequencing

5- روش­های در حال توسعه

• Tunnelling currents DNA sequencing
• Sequencing by hybridization
• Sequencing with mass spectrometry
• Microfluidic Sanger sequencing
• Microscopy-based techniques
• RNAP sequencing
• In vitro virus high-throughput sequencing

یک مثال از نتایج حاصل از تعیین توالی DNA خاتمه زنجیره ای خودکار

منابع:

1. Olsvik O, Wahlberg J, Petterson B, Uhlén M, Popovic T, Wachsmuth IK, Fields PI (January 1993). “Use of automated sequencing of polymerase chain reaction-generated amplicons to identify three types of cholera toxin subunit B in Vibrio cholerae O1 strains”. Clin. Microbiol. 31 (1): 22–25. PMC262614. PMID 7678018.
2. Pettersson E, Lundeberg J, Ahmadian A (February 2009). “Generations of sequencing technologies”. Genomics. 93 (2): 105–11. doi:1016/j.ygeno.2008.10.003. PMID18992322.
3. Moréra, Solange; Larivière, Laurent; Kurzeck, Jürgen; Aschke-Sonnenborn, Ursula; Freemont, Paul S; Janin, Joël; Rüger, Wolfgang (August 2001). “High resolution crystal structures of T4 phage β-glucosyltransferase: induced fit and effect of substrate and metal binding”. Journal of Molecular Biology. 311 (3): 569–577. doi:1006/jmbi.2001.4905. PMID11493010.
4. Ehrlich, Melanie; Gama-Sosa, Miguel A.; Huang, Lan-Hsiang; Midgett, Rose Marie; Kuo, Kenneth C.; McCune, Roy A.; Gehrke, Charles (1982). “Amount and distribution of 5-methylcytosine in human DNA from different types of tissues or cells”. Nucleic Acids Research. 10 (8): 2709–2721. doi:1093/nar/10.8.2709. PMC320645. PMID 7079182.
5. Ehrlich, M; Wang, R. (19 June 1981). “5-Methylcytosine in eukaryotic DNA”. Science. 212 (4501): 1350–1357. Bibcode:..212.1350E. doi:10.1126/science.6262918. PMID6262918.
6. Song, Chun-Xiao; Clark, Tyson A; Lu, Xing-Yu; Kislyuk, Andrey; Dai, Qing; Turner, Stephen W; He, Chuan; Korlach, Jonas (20 November 2011). “Sensitive and specific single-molecule sequencing of 5-hydroxymethylcytosine”. Nature Methods. 9 (1): 75–77. doi:1038/nmeth.1779. PMC3646335. PMID 22101853.