دی‌ان‌ای لیگاز (DNA ligase)

DNA لیگاز در حال ترمیم آسیب DNA کروموزومی

دی‌ ان ای لیگاز، نوع خاصی از آنزیم لیگاز است که اتصال رشته­های DNA به یکدیگر را توسط کاتالیز پیوند فسفو­دی­استر، تسهیل می­کند. این آنزیم در تعمیر شکست­ها در مناطقی از DNAی دورشته ای که تک رشته ای شده است نقش دارد، اما بعضی اَشکال آن (مثل دی ان ای لیگاز IV) ممکن است به­طور ویژه شکست­های DNA دو­رشته­ای را ترمیم کند.

به منظور ترمیم شکست های تک رشته ای، از رشته مکمل به عنوان الگو استفاده می شود. سپس دی ان ای لیگاز وارد عمل شده و آخرین پیوند فسفو­دی­استر را ایجاد می­کند تا ترمیم DNA تکمیل شود^(۱).

دی ان ای لیگاز هم در مکانیسم ترمیم DNA و هم در مکانیسم تکثیر DNA مورد استفاده قرار می­گیرد. به علاوه، به وفور در آزمایشگاه­های زیست­شناسی مولکولی به منظور تولید DNA نوترکیب کاربرد دارد. از دی ان ای لیگاز خالص­شده در کلونینگ ژن برای اتصال مولکول­های DNA به یکدیگر به منظور تشکیل DNA نوترکیب استفاده می شود.

اولین دی ان ای لیگاز در سال 1967 خالص­سازی و معرفی شد. متداول­ترین دی­ان­ای لیگازهای تجاری از باکتریوفاژ T4، E.coli و باکتری­های دیگر گرفته شده اند^(۶).

مکانیسم لیگاز

مکانیسم دی ان ای لیگاز، تشکیل دو پیوند کووالانسی فسفو­دی­استر بین انتهای ´3 هیدروکسیل از یک نوکلئوتید (“گیرنده”)، با انتهای ´5 فسفات دیگر (“دهنده”) است. لیگاز برای اینکه بتواند نقش خود را ایفا کند، به ATP نیاز دارد که طی 4 مرحله فراهم می­شود:

• سازماندهی مجدد جایگاه های فعالیت مانند حفره های موجود در قطعات DNA یا قطعات اکازاکی
• آدنیلاسیون یک باقی مانده لیزین در جایگاه فعال آنزیم، که این باعث آزاد شدن پیرو­فسفات می­شود
• انتقال AMP به فسفات ´5 دهنده که در نتیجه آن یک پیوند پیروفسفات تشکیل می شود
• تشکیل یک پیوند فسفو­دی­استر بین فسفات ´5 دهنده و هیدروکسیل ´3 گیرنده.

لیگاز، اتصال انتهاهای صاف (blunt end) را نیز کاتالیز می کند؛ هرچند غلظت­های زیاد آنزیم و واکنش­های مختلفی مورد نیاز است^(۲).

تصویری شماتیک از چگونگی فعالیت لیگاز (با انتهای چسبنده)

انواع لیگاز­ها

DNA لیگاز E. coli

دی ان ای لیگاز باکتری E.coli توسط ژن lig کدگذاری می­شود. دی ان ای لیگاز در E.coli و همچنین بسیاری از پروکاریوت­ها، از انرژی به­دست آمده توسط شکستن دی­نوکلئوتید آدنین نیکوتین آمید (NAD) برای ایجاد پیوند فسفو­دی­استر استفاده می­کنند^(۳). این لیگاز توانایی بستن انتهاهای صاف (blunt) DNA را جز در شرایط ازدحام مولکولی با پلی­اتیلن گلیکول ندارد و علاوه بر این نمی­تواند RNA را به­طور کارآمدی به DNA متصل کند.

دی ان ای لیگاز T4

DNA لیگاز باکتریوفاژ T4 معمول­ترین لیگازی است که در آزمایشگاه­های تحقیقاتی مورد استفاده قرار می گیرد^(۴). این لیگاز می­تواند انتهای چسبنده­ی DNA، الیگونوکلئوتیدها و همچنین هیبریدهای RNA و RNA-DNA را ببندد، اما اسید‌نوکلئیک تک‌رشته‌ای را نه. همچنین می­تواند انتهاهای صاف DNA را با کارآمدی بیشتری از دی ان ای لیگاز E.coli مسدود کند. بر­خلاف دی ان ای لیگاز E.coli، DNA لیگاز T4 نمی­تواند NAD را مورد استفاده قرار دهد و برای فعالیت نیاز به ATP (به عنوان یک کوفاکتور) دارد^(۵).

لیگاز­های پستانداران

در پستانداران چهار نوع خاص از لیگاز وجود دارد: دی ان ای لیگاز یک، دو،سه و چهار. دی ان ای لیگاز یوکاریوت­ها و برخی میکروب­ها از آدنوزین تری فسفات (ATP) به جای NAD استفاده می کند^(۳).

لیگاز­های مقاوم به حرارت

لیگاز­هایی از باکتری­های گرما­دوست مختلف، کلون و توالی­یابی شده­اند و به دلیل خواص مقاوم به حرارتی که دارند کاربردهای تجاری یافته اند.

کاربرد دی­ان­ای لیگاز در تحقیقات زیست­شناسی مولکولی

دی ان ای لیگازها ابزارهای ضروری در تحقیقات زیست­شناسی مولکولی مدرن برای ایجاد توالی­های DNA نوترکیب هستند. برای مثال، دی ان ای لیگازها به همراه آنزیم­های محدودکننده برای ورود قطعات DNA( اغلب ژن­ها) به درون پلاسمیدها استفاده می­شوند.

منابع:

1. Pascal JM, O’Brien PJ, Tomkinson AE, Ellenberger T (November 2004). “Human DNA ligase I completely encircles and partially unwinds nicked DNA”. Nature. 432 (7016): 473–8. doi:1038/nature03082. PMID15565146.
2. Lehman IR (November 1974). “DNA ligase: structure, mechanism, and function”. Science. 186 (4166): 790–7. doi:1126/science.186.4166.790. PMID4377758.
3. Foster JB, Slonczewski J (2010). Microbiology: An Evolving Science (Second ed.). New York: W. W. Norton & Company. ISBN0-393-93447-0.
4. Enzyme Resources Guide. Promega Corporation. pp. 8–14.
5. Wilson RH, Morton SK, Deiderick H, Gerth ML, Paul HA, Gerber I, Patel A, Ellington AD, Hunicke-Smith SP, Patrick WM (July 2013). “Engineered DNA ligases with improved activities in vitro”. Protein Eng. Des. Sel. 26 (7): 471–8. doi:1093/protein/gzt024. PMID23754529.
6. Weiss B, Richardson CC (April 1967). “Enzymatic breakage and joining of deoxyribonucleic acid, I. Repair of single-strand breaks in DNA by an enzyme system from Escherichia coli infected with T4 bacteriophage”. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 57 (4): 1021–8. doi:1073/pnas.57.4.1021. PMC224649. PMID 5340583.